桐树基因检测技术助力国内首个多组学胰腺癌异质性研究登陆JCR TOP10 期刊

胰腺导管腺癌(PDAC)是一种侵袭性恶性肿瘤，5年生存率低于8%。传统疗法能否有效治疗PDAC，部分取决于肿瘤的异质性。近年，多种组学研究分析显示强调了个体间PDAC高度的肿瘤间异质性和同一肿瘤内的肿瘤内异质性，其中包括基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等等。同时，整合基因组学、转录组学和表观基因组学等分析为PDAC的潜在治疗策略提供了见解，但基于PDAC的多组学概要和肿瘤演化的异质性分析数据仍十分缺乏。

19例PDAC患者的61个PDAC病变样本，以及匹配的胰腺正常组织或血液样本被纳入检测并分析。苏木精-伊红(H&E)染色用于显示组织学层面的肿瘤内和肿瘤间异质性。对来自多个区域的样本分别进行全外显子组测序(WES)、转录组测序(RNA-seq)和甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP-seq)，并通过CNAmet去整合分析多组学数据，全面揭示PDAC的异质性，识别PDAC的潜在生物标志物。

图1. 研究流程示意图

病理检测结果显示，在同一肿瘤中，分化良好(如P1-L1、P1-L3、P16-L3)和中分化病变(如P1-L2、P16-L1、P16-L2)共存(图2)，提示PDAC的肿瘤内组织学异质性。同时不同个体肿瘤的分化状态也存在很大差异，提示PDAC的肿瘤间组织学异质性。

图2. 代表性样本的形态异质性

WES结果显示体细胞突变在同一肿瘤病变之间存在差异，其中错义突变占主导地位(91.8%)，其次是无义突变(5.1%)和剪接位点突变(2.4%)。最常见的驱动基因突变发生在KRAS(77.0%)、TP53(59.0%)和CDKN2A(23.0%)（图3A）。所有病灶的TMB平均值为1.11突变/MB，范围为0.37 ~ 6.29突变/MB(图3B)。除P7-L1(6.29个突变/MB)外，其余病灶TMB值均较低(≤5个突变/MB)。8q24.22、16p11.2、9p12、9p11.2和3q29染色体的获得和4p13、21q22.11、18p11.23、7q36.3和13q12.12染色体的丢失是最常见的CNVs。CNV负荷在单个肿瘤内或不同肿瘤之间存在差异(图3C)。

图3. PDAC驱动基因的体细胞突变和拷贝数变异

不同肿瘤内部或不同肿瘤之间的病变表现出不同的进化路径。在系统发育树中，每个患者有6~10个簇，树干上的snv数量从3~63个不等。分支变异与主干变异相比，在所有患者中占主导地位。特别地，KRAS、TP53和CDKN2A突变与其他驱动突变相比更可能位于主干（图4）。另外，一些变异，如BCL11A突变、KIF5B突变和染色体臂11q缺失，完全或主要被归类为早期克隆，发生在基因组复制之前，这表明这些变异是最初的基因组事件。而一些改变，如CEBPA和CACNA1A突变，完全或主要是晚期克隆的，经常发生在基因组复制后，这表明这些改变有助于肿瘤的维持和进展（图5）。

图4. 肿瘤的进化分析

图5. PDAC进化过程中体细胞变异事件发生的时间异质性

对随机选择的12名PDAC患者的40个病变样本及其匹配的正常组织样本进行了RNA-seq。结果显示差异表达基因(DEGs)的数量在个体肿瘤内或不同的病变样本之间是不同的，聚类分析进一步验证该结果（图6A&B）。而对于肿瘤微环境(TME)的异质性，聚类分析显示样本分为两类，这两组细胞表现出不同的免疫细胞谱，簇2中CD4 naive T细胞和T滤泡辅助细胞的比例显著高于簇1。来自同一肿瘤的病灶没有聚集在一起，提示在同一患者中TME比肿瘤细胞更具异质性（图6D）。

为了进一步解释肿瘤的表型多样性，采用MeDIP-seq在表观遗传水平上研究PDAC的异质性。图6E显示了随机选择的7例PDAC患者的系统进化树，同一患者病变间差异甲基化区域(DMRs)存在显著差异，反映了PDAC的瘤内异质性(图6F)。对肿瘤高甲基化区域的分析进一步证实了肿瘤内的异质性，且肿瘤内的异质性低于肿瘤间的异质性(图6G)。

图6. PDAC的转录和表观遗传异质性

进一步整合多种组学数据分析结果表明，除了突变状态、CNV和DNA甲基化，其他因素可能会影响PDAC驱动基因的表达（图7）。同时，ZNF521在除P9-T4肿瘤外所有P8-P19肿瘤样本中均呈低表达，KDM6A拷贝数的丢失也发生在所有样本中。提示ZNF521的低表达和KDM6A拷贝数的丢失可能作为PDAC的生物标志物（图8）。

图7.基因组改变与RNA表达的联系

图8. 部分基因mRNA表达与CNV或甲基化状态的相关性

预后分析结果显示，肝转移患者的平均CNV负荷明显高于其他患者(P = 0.033)。而高CNV负荷的患者的生存期也显著缩短（DFS, P = 0.0462 & OS, P=0.1884）。另外，ZNF521低表达患者虽然预后较差，但结果无统计学意义（图9）。

图9. CNV burden及相关指标的预后相关性分析

• 多组学联合分析为PDAC的分子异质性和进化轨迹提供了一个全面的视角；

• ZNF521的低表达和KDM6A拷贝数的丢失可能作为PDAC的生物标志物；

• 平均CNV负荷是PDAC的潜在预后因素。

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